站在共聚焦成像與雙光子顯微術的高水平上

尼康A1R MP 是一款雙光子顯微成像系統，不僅具備高分辨率檢流計式掃描器（galvanometer scanner），而且還配備了高速共振式掃描器（resonant scanner）。掃描速率在512 × 512像素水平下高達到30幀/秒；在帶狀掃描模式下可達420幀/秒。新型四通道NDD探測器（non-descanned detectors）具有更高的探測效率、更低的暗電流以及更寬的響應光譜，可以對譜線相近的熒光探針進行實時光譜拆分與識別，并大大提高熒光圖像的對比度。此功能對于雙光子顯微鏡非常重要，因為在雙光子成像時一般只能使用單一的激發波長，往往不可避免地造成自發熒光以及發射光譜的重疊。

高達420幀/秒成像速率的共振掃描鏡

尼康所的共振掃描技術，較之于非共振的普通掃描器，大幅提高了寬視場掃描速率，達到了點掃描成像的快速率-420幀/秒。利用多光子顯微術專用的NDD探測器，可以對非常厚的標本進行深部快速成像。尼康的光學同步（optical pixel clock）技術充分保證了超高速圖像的均勻性和穩定性。

*1 NDD（Non-Descanned Detector）,與共聚焦技術不同，A1R MP不需要使用小孔濾波（descan）。使得NDD探測器可以安裝在最靠近物鏡出光口的位置，從而可以接收到更多的被厚標本散射的信號光，大幅提高靈敏度。

活體微循環成像

通過A1R MP的超高速共振掃描，利用紅外飛秒脈沖激光激發活體組織血管中的血細胞，并以30幀/秒（30msec）速率，三通道同時拍攝三色熒光圖像。

箭頭標記的是對白細胞胞核運動的追蹤。

三種熒光探針同時成像：細胞核（藍），內皮細胞層（綠），血漿（紅）。長波長超快激光與超高速掃描器的結合有效降低光損傷的同時提供了高精度時間分辨率的多光子成像。圖像分辨率：512×512pixels，圖像采集速率：30幀/秒，物鏡：60x水鏡。

高靈敏度NDD深部成像

尼康新開發的多光子四通道NDD探測器能夠有效地進行標本深部的顯微成像。較普通探測器而言，NDD的感光元件面積更大，靈敏度更高，并安裝于距離物鏡后出光口（back aperture）最近的地方. 該配置有效地提高了對散射熒光的探測效率，具有更高的信噪比（S/N），對諸如活體組織等較厚的標本的拍攝，具有比普通共聚焦顯微鏡更為清晰穩定的圖像質量。

對于標本深部成像來說，非常重要的一點就是要盡可能多地探測到散射熒光。而實際探測深度主要取決于探測器的靈敏度、受光面積以及安裝位置。

13.5日齡大鼠胚胎脊髓原基（神經管）的深部成像。樣品為電轉綠色熒光蛋白并培養24h后的完整胚胎。固定好的橫切脊髓浸入凝膠中，并用紅外脈沖激光進行雙光子激發，可以觀察到600微米以上的深部區域。

NDD探測器拍攝的固定小鼠大腦神經元標本（eGFP染色）通過雙光子紅外激光（920nm）可以獲得比常規共聚焦更高信噪比（S/N)的腦組織深部成像。能夠實現深度在600微米以上光學切層觀察。實驗中使用了新型CFI Apo LWD 40x WI λs物鏡。

新款高NA物鏡成像更清晰，更明亮

新款水浸物鏡在較寬的波長范圍內做了色差校正，保證了在近紫外到近紅外波段內都有很高的透過率。其中尼康的CFI Plan Apo IR 60x WI是目前世界上數值孔徑（NA）的60x水浸物鏡，用它拍攝的高對比度顯微圖像具有非常出色的亮度和分辨率。

一種原來為尼康半導體光刻機開發的超低折射率薄膜。由納米顆粒組成海綿狀“粗糙”結構，從而在很寬的光譜區間上大幅提升了光線透過率。

尼康雙光子顯微鏡物鏡

N 納米水晶鍍膜（Nano Crystal Coat-deposited）

圖一 圖二 圖三

（圖一）轉染GFP的13.5日齡大鼠胚胎脊髓原基（神經管），標本為經24小時培養后并固定的完整胚胎。神經上皮細胞與遷移中間神經元的連合軸突都清晰可見。

（圖三）表達eGFP小鼠大腦神經元的固定標本圖像通過雙光子紅外激光（920nm）可以獲得比常規共聚焦更高信噪比（S/N）的腦組織深部成像。

快速精準的光譜拆分

A1R MP不僅可以通過光譜探測器進行32通道光譜拆分，而且實現了利用四通道NDD探測器的光譜拆分功能。此功能同樣適用于高速共振掃描器。因此，A1R MP可以實現厚標本的深部高速高對比度成像。

經Alexa488、MitoTracker Red和DAPI染色的標本，由光譜探測器拍攝的雙光子激發圖像并經光譜拆分處理。雙光子紅外激發光能夠有效減少對細胞的損傷。

多光子激光光束的一鍵準直

當多光子激光的波長或群速色散（GVD）預補償發生改變時，激光的位置會發生偏移，導致熒光圖像亮度不均勻，以及單光子圖像與雙光子圖像之間的錯位。

由于人眼無法看見多光子激光，特別是800 nm以上波長。因此多光子激光束的準直工作對普通用戶來說是十分困難也是十分危險的。尼康的A1R MP新開發的自動光束準直功能可以讓用戶輕點鼠標，瞬間完成多光子激光的光束準直。