藻類表型研究全面解決方案

藻類是藍藻門、眼蟲藻門、金藻門、甲藻門、綠藻門、褐藻門、紅藻門等一系列水生生物的總稱。其形態種類眾多，小至微米級的單細胞微藻，大至長達幾米乃至幾十米的大型褐藻。藻類作為水體中重要的初級生產者，對整個生態系統乃至地球圈的穩定都起著極為重要的作用。萊茵衣藻、藍藻等模式藻類為功能基因、生物進化、光合作用等研究提供了的材料。同時，很多經濟藻類也在食品、醫藥、能源等行業中扮演重要角色。而水華、赤潮等有害生態現象也是由藻類造成的。因此，對藻類的研究一直是生物學和生態學中非常重要的熱點

目前生命科學研究領域引人注目的研究熱點之一——表型組學研究，還主要集中在植物/作物領域。在藻類領域，表型組學研究剛剛起步，但發展速度極為迅猛。藻類表型組學一方面是藻類基因組學的補充與驗證，解釋基因組和環境因素對植物表型的復雜作用及中間的變化過程；另一方面可以用于經濟藻類的抗逆生理研究和遺傳育種，全面分析藻類表型，獲取更優良的經濟藻種；還可以用于水華、赤潮的發生機理研究。

藻類表型組學需要全面分析藻類的表型特征，尤其是光合生理、形態、顏色、色素組成與分布、不同色素的光合貢獻、脅迫生理等方面的測量與分析，使藻類表型數字化、生理生態及功能可視化。這就需要針對藻類表型專門設計的技術解決方案。

方案中所列舉的儀器可以根據具體研究需求靈活組合，而且所有儀器的認可度*，國內外科學家均使用這些儀器發表了大量科研論文。下面介紹部分系統方案的應用案例。

1. 藍藻光合作用機理的深入研究

中科院水生生物所王強研究員為了研究亞硝酸鹽脅迫對藍藻Synechocystis sp. PCC 6803光系統II的脅迫機制，使用AquaPen手持式藻類熒光測量儀、FL3500葉綠素熒光儀（FL6000之前型號）和TL葉綠素熱釋光系統，分別測量分析了Fv/Fm大光化學效率、OJIP快速熒光動力學曲線、QA-再氧化動力學曲線、S-state測量和TL熱釋光曲線。研究終證明亞硝酸鹽脅迫首先影響Synechocystis sp. PCC 6803 光系統II受體側(Zhan X, 2017)

左：實驗樣品；中：Fv/Fm；右：OJIP快速熒光動力學曲線

左：QA-再氧化動力學曲線；中：S-state測量：右：TL熱釋光曲線

左：AquaPen手持式藻類熒光測量儀；中：FL3500雙調制葉綠素熒光儀；右：TL葉綠素熱釋光系統

參考文獻：Zhang X, Ma F, Zhu X, Zhu J, Rong J, Zhan J, Chen H, He C, Wang Q. 2017. The acceptor side of photosystem II is the initial target of nitrite stress in Synechocystis sp. strain PCC 6803. Appl Environ Microbiol 83:e02952-16

2. 萊茵衣藻分子事件的多組學解析

萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii的新陳代謝對環境變化有很好的適應性。加利福尼亞大學的Daniela Strenkert嘗試模擬一個光暗周期，研究這一天中萊茵衣藻的轉錄組與蛋白質組變化。這一研究首先要求能夠精確模擬一個動態變化的培養環境，同時還要對相關培養環境及藻類密度、生理等進行監測。這樣才能為后續的組學分析提供盡量精準的樣品。而目前能達到這一要求的藻類培養監測儀器只有FMT150藻類培養與在線監測系統。其培養條件設置如下：

n 多臺FMT150同步培養

n 200 μE紅/藍光，12小時晝夜交替，模擬日升日落

n 白天28 ℃，夜晚18 ℃

n 通氣速度0.2 L/min

n 實時監測溫度、OD680和pH

恒濁預培養5天，控制OD680至0.4

左：A.FMT150示意圖，B-D.培養過程中實時監測溫度、OD680和pH；右：不同光強下大光化學效率Fv/Fm的動態變化

葉綠素熒光分析是光合生理和表型組學研究*的部分。因此本研究同時使用FluorCam封閉式熒光成像系統測量不同光強下萊茵衣藻大光化學效率Fv/Fm的動態變化，反映光強對萊茵衣藻的影響并與蛋白質組、轉錄組數據進行相關分析

左：FMT150藻類培養與在線監測系統；右：FluorCam封閉式葉綠素熒光成像系統

參考文獻：Strenkert D, et al. 2019, Multiomics resolution of molecular events during a day in the life of Chlamydomonas. PNAS 116 (6): 2374-2383

3. 監測南極藻類與地衣的氣候響應

2006年，捷克在南極James Ross島建設了Johann Gregor Mendel站。駐扎該站的捷克馬薩里克大學科研人員從2007年就開展研究當地藻類和地衣對南極溫度升高的響應，從而評估溫室效應對南極生態系統的影響。當時他們使用了專門加強極地適應能力的AquaPen/FluorPen系列手持式葉綠素熒光測量儀來檢測藻類和地衣的光合生理和生長狀態。AquaPen/FluorPen既可以手動操作，也具備無人值守監測葉綠素熒光的功能，在南極的嚴酷環境下表現良好。

而近年，科研人員開始使用專門設計用于監測實驗的Monitoring Pen葉綠素熒光自動監測儀。Monitoring Pen在理想情況下可自動連續工作2年，配有陸地增強版和水下增強版兩個版本。

左：Johann Gregor Mendel站2007-2009年使用的AquaPen/FluorPen；右：近年開始使用的Monitoring Pen

左：Monitoring Pen陸地增強版；右：Monitoring Pen水下增強版

參考文獻：Barták M, et al. 2009, Long-term study on vegetation responses to manipulated warming using open top chambers installed in three contrasting Antarctic habitats. Structure and function of antarctic terrestrial ecosystems, Masaryk University

4. 萊茵衣藻高光脅迫響應的分子機制

所有光合生物都必須要應對過量光照來避免光合氧化脅迫。對于植物和綠藻來說，高光的響應機制就是光系統II的非光化學淬滅（NPQ）。這一過程允許光系統II將過量能量以熱量形式安全地耗散掉。PsbS蛋白是這一過程中的重要傳感器。

為了確定PsbS蛋白在萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii的NPQ和光保護中的作用，艾克斯－馬賽大學Tibiletti T等培養了可以表達藻類或擬南芥psbS基因的葉綠體轉基因株。通過FluorCam開放式葉綠素熒光成像系統進行的NPQ成像分析終表明，兩種PsbS蛋白都可以增強萊茵衣藻野生型和npq4突變株的NPQ，但通過Fv/Fm測量沒有觀察到明確的光保護活性。

左：NPQ成像圖；中：光暗周期中的NPQ動態變化；右：Fv/Fm數據分析

同時，他們還使用了兩個白光LED光源板來模擬持續高光脅迫（1200 µmol m-2 s-1）；Fytoled光源系統來模擬波動光照條件（3分鐘1200µmol m-2 s-1+3分鐘45µmol m-2 s-1）進行生長率實驗；FluorCam系統自帶藍色LED光源板模擬波動光照條件（3分鐘1200µmol m-2 s-1+3分鐘20µmol m-2 s-1）進行Fv/Fm分析。這些LED光源板實際都來自于同一技術來源，即PSI公司的SL3500 LED光源板。這一LED光源的開發就是為了給FluorCam系統測量葉綠素熒光成像提供高強度、高均一度、高純度的光照，同時配備精確到微秒級的自動調控功能。以此LED光源為基礎開發的培養系統自然就具備了其他培養系統無法達到的高性能。歐美很多研究者都會使用這一光源搭建自己設計的培養系統。比如2012年Nature發表的“Recovery rates reflect distance to a tipping point in a living system”一文中，作者就使用了SL3500光源搭建了自主設計的藻類培養系統。

左：FluorCam開放式葉綠素熒光成像系統；中：SL3500 LED光源板；右：AlgaeTron/FytoScope藻類/植物培養箱

參考文獻：Tibiletti T, et al. 2016. Chlamydomonas reinhardtii PsbS protein is functional and accumulates rapidly and transiently under high light. Plant Physiology, 171(4): 2717-2730