分子生物學是在分子水平研究蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子結(jié)構與功能的學科,是生物學的前沿領域。分子生物學的研究需要對生物大分子進行檢測,常用的儀器包括PCR儀、核酸提取儀等。除了專門的分子生物學儀器,通用的化學分析儀器也在分子生物學中有廣泛的應用,比如紫外分光光度計。
紫外分光光度計在分子生物學中主要有以下幾點應用:
1.蛋白質(zhì)含量測定
(1)直接定量法:
利用紫外分光光度計直接定量檢測蛋白質(zhì)含量是利用蛋白質(zhì)含有的*和*在紫外光區(qū)280 nm處具有大吸收的特征,根據(jù)該波長的吸光度與蛋白質(zhì)濃度成正比的關系測定其含量。
直接定量法適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。特點在于快速簡便,缺點包括易受到平行物質(zhì)如DNA的干擾、敏感度差、要求蛋白的濃度較高等。
(2)比色法:蛋白質(zhì)的組成成分氨基酸與外加的顯色基團或染料反應,產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物的濃度與氨基酸的數(shù)量相關,從而反映蛋白質(zhì)濃度。常見方法包括BCA、Bradford、Lowry等幾種。
2.核酸濃度測定和純度判定
核酸的大吸收波長是260 nm,蛋白質(zhì)的大吸收波長是280 nm。在波長260 nm的紫外線下,1 OD值光密度相當于約50 μg/mL雙鏈DNA,約40 μg/mL單鏈DNA或RNA。通過OD260與OD280的比值還可初步判斷核酸的純度,純DNA和RNA樣品的0D260/280分別為1.8和2.0,若樣品中有蛋白質(zhì)或酚的污染,比值將低于此值。
紫外分光光度計一般只能測定質(zhì)量濃度大于0.25 μg/mL的核酸濃度。
3.細菌密度測定
通常情況下,根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細菌的生長密度和生長期,而OD600是用來檢測細菌濃度的重要指標,是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標準方法。實驗中以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液,再定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。注意受試的樣品不能離心,要保持細菌懸浮狀。
紫外分光光度法是基礎的光譜分析方法,根據(jù)被測量物質(zhì)分子對紫外-可見波段范圍單色輻射的吸收或反射強度來進行物質(zhì)的定量、定性或結(jié)構分析。紫外分光光度法的應用很廣泛,可用于化學、材料、生物、醫(yī)學、食品、環(huán)境等領域。分子生物學中的應用是指其中的一小部分。
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