1.流動相必須用HPLC級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質和其他物質[使用0.45um或更細的膜過濾] 
2.流動相過濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應該恢復到室溫后使用
3.不能用純乙腈作為流動相，這樣會使單向閥粘住而導致泵不進液
4.使用緩沖溶液時，做完樣品后應立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時，然 后用甲醇[或甲醇水溶液]沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子對于柱塞桿 外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20ml以上

5.長時間不用儀器，應該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應該用有機相[如甲醇等]，因為純水易長霉
6.每次做完樣品后應該用溶解樣品的溶劑清洗進樣器
7.C18柱不能進蛋白樣品，血樣生物樣品
8.堵塞導致壓力太大，按預柱混合器中的過濾器管路過濾器單向閥檢查 并清洗清洗方法；以異丙醇作溶劑沖洗：放在異丙醇中間用超聲波清 洗；用10％稀硝酸清洗
9.氣泡會致使壓力不穩，重現性差，所以在使用過程中要盡量避免產生氣泡
10.如果進液管內不進液體時，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進行流動相 的清洗
11.要注意柱子的PH值范圍，不得注射強酸強堿的樣品，特別是堿性樣品
12.更換流動相時應該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動邊靖洗，然后插入新的 流動相中更換無互溶性的流動相時要用異丙醇過渡一下

常見故障的斷定及解決
可能的原因及解決方法 
[一]保留時間變化 
1.柱溫變化 柱恒溫，必要時需配置恒溫箱
2.等度與梯度間未能充分平衡 至少用10倍柱體積的流動相平衡柱
3.緩沖液容量不夠 用25mmol/L的緩沖液
4.柱污染 每天沖洗柱
5.柱內條件變化 穩定進樣條件,調節流動相
6.柱快達到壽命 采用保護柱
[二]保留時間縮短 
1.流速增加 檢查泵,重新設定流速
2.樣品超載 降低樣品量
3.鍵合相流失 流動相PH值保持在3~7.5檢查柱的方向
4.流動相組成變化 防止流動相蒸發或沉淀
5.溫度增加 柱恒溫
[三]保留時間延長 
1.流速下降 管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內氣泡
2.硅膠柱上活性點變化 用流動相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱

3.鍵合相流失 同前[二]3
4.流動相組成變化 同前[二]4
5.溫度降低 同前[二]5
[四] 出現肩峰或分* 
1.樣品體積過大 用流動相配樣,總的樣品體積小于*峰的15%
2.樣品溶劑過強 采用較弱的樣品溶劑
3.柱塌陷或形成短路通道 更換,采用較弱腐蝕性條件
4.柱內燒結不銹鋼失效 更換燒結不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品
5.進樣器損壞 更換進樣器轉子
[五]鬼峰
1.進樣閥殘余峰 每次用后用強溶劑清洗閥,改進閥和樣品的清洗
2.樣品中未知物 處理樣品
3.柱未平衡 重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑 [尤其是離子對色譜]

4.三fu乙酸[TFA]氧化[肽譜] 每天新配,用抗氧化劑
5.水污染[反相] 通過變化平衡時間檢查水質量，用HPLC級的水
[六] 基線噪聲 
1.氣泡[尖銳峰] 流動相脫氣,加柱后背壓
2.污染[隨機噪聲] 清洗柱,凈化樣品,用HPLC級試劑
3.檢測器燈連續噪聲 更換氘燈
4.電干擾[偶然噪聲] 采用穩壓電源,檢查干擾的來源[如水浴等]
5.檢測器中有氣泡 流動相脫氣,加柱后背壓
[七]峰拖尾 
1.柱超載 降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相
2.峰干擾 清潔樣品,調整流動相
3.硅羥基作用 加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相PH值,鈍化樣品

4.同前[四]4 同前[四]4
5.同前[四]3 5.同前[四]3
6.死體積或柱外體積過大 連接點降至zui低,對所有連接點作合適調整,盡可能采用細內徑的連接管
7.柱效下降 用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護柱
[八]峰展寬 
1.進樣體積過大 同[四]1
2.在進樣閥中造成峰擴展 進樣前后排出氣泡以降低擴散
3.數據系統采樣速率太慢 設定速率應是每峰大于10點
4.檢測器時間常數過大 設定時間常數為感興趣*峰半寬的10%
5.流動相粘度過高 增加柱溫,采用低粘度流動相
6.檢測池體積過大 用小體積池,卸下熱交換器
7.保留時間過長 等度洗脫時增加溶劑含量也可用梯度洗脫
8.柱外體積過大 將連接管徑和連接管長度降至zui小
9.樣品過載 進小濃度小體積樣品

液相使用經驗談
色譜柱在使用前，進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品流動相柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行[出廠測試所使用的條件是*條件]，只有這樣，測得的結果才有可比性 

1樣品的前處理： 
a使用流動相溶解樣品 
b使用予處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質 
c使用0.45µm的過濾膜過濾除去微粒雜質 
2流動相的配制： 是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流 
動相具備以下的特點： 
a流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中[或長時間保留在柱中] 
b流動相具有一定惰性，與樣品不產生化學反應[特殊情況除外] 
c流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果；同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命[可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度] 

d流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應如使用UV檢測器，使用對紫外吸收較低的溶劑配制 
e流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行 
f在流動相配制好后，一定要進行脫氣除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用
2流動相流速的選擇： 因柱效是柱中流動相線性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效對于一根特定的，要追求*柱效，使用*流速對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳 當選用*流速時，分析時間可能延長可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間[如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量] 
注意： 
a．由于甲醇廉價，對于反相柱推薦使用甲醇體系[必須使用乙腈的場合除外] 
b．對于正相柱推薦使用沸程為30-60的石油醚或提純后的己烷作流動相，沒有提純的己烷不得使用用水使用超純水[電阻率大于18兆歐]，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質，有可能影響分析結果 
c．含水流動相zui*在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜加入*，防止細菌生長 
d．流動相要求使用0.45 µm濾膜過濾，除去微粒雜質 

e．使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長的使用壽命，提高柱性能
的常用術語
1色譜曲線romatogram）：色譜柱流出物通過檢測器系統時所產生的響應信號對時間或流動相流出體積的曲線圖，或者通色譜圖（ch過適當的方法觀察到的紙色譜或薄層色譜斑點譜帶的分布圖
2（色譜）峰（chromatographic peak）：流出組分通過檢測器系統時所產生的響應信號的微分曲線
3峰底（peak base）：峰的起點與終點之間的連接的直線
4峰高（h ，peak height）：色譜峰zui大值點到峰底的距離
5峰寬（W ，peak width）：在峰兩側拐點處所作切線與峰底相交兩點的距離
6半高峰寬（W h/2 ，peak withd at half height）：通過峰高的中點作平行于峰底的直線，此直 線 與峰兩側相交兩點之間的距離（圖1 中的HJ）
7峰面積（A ，peak area）：峰與峰底之間的面積（圖1中的CHEJDC）
8拖尾峰（tailing peak）：后沿較前沿平緩的不對稱的峰
9前伸峰（leading peak）：前沿較后沿平緩的不對稱的峰（又叫伸舌峰前延峰）

10假峰（ghost peak）：除組分正常產生的色譜峰外，由于儀器條件的變化等原因而在譜圖上出現的色譜峰，即并非由試樣所產生的峰這種色譜峰并不代表具體某一組分，容易給定性定量帶來誤差（又叫鬼峰）
11畸峰（distrorted peak）：形狀不對稱的色譜峰， 前伸峰拖尾峰都屬于這類 
12反峰（negative peak）：也稱倒峰負峰，即出峰的方向與通常的方向相反的色譜峰
柱的使用和維護注意事項[推薦]
的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效縮短使用壽命甚至損壞在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱
避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動溫度的突然變化或者使從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩（如前所述）
.應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然
一般說來不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質否則反沖會迅速降低柱效
選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠"飽和"，避免分析柱中的硅膠基質被溶解

經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質在進行清洗時，對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規分析需要50~75ml
下面列舉一些的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使硅膠表面重新活化反相柱以水甲醇乙腈一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么可以省略zui后用水沖洗這一步一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質，在甲醇（乙腈）沖洗時重復注射100~200µl四氫呋喃數次有助于除去強疏水性雜質四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂有時也注射二甲亞砜數次此外，用乙腈丙酮和三fu醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質污染陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然后用水甲醇二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機物）甲醇水依次沖洗
保存時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發干燥禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過夜或更長時間
色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大在后兩種情況發生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內填料整平然后用適當溶劑濕潤的固定相（與柱內相同）填滿，壓平，再擰緊柱接頭這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復到新柱的水平柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護延長柱壽命的作用采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的 通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上以硅膠為基質的填料，只能在pH2~9范圍內使用柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強的物質保留于柱頂，特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂的填料上新的在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復每次工作完后，用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡當采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應用無鹽流動相沖洗含鹵族元素（fu氯溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸裝在HPLC儀上柱子如不經常使用，應每隔4~5天開機沖洗15分鐘

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來源成都雅源科技