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濟南賽暢科學儀器有限公司
主營產品：氣相色譜儀整機、配件、消耗品(申分、福立、捷島、上分、安捷倫、布魯克等),液相色譜儀整機、配件、消耗品(島津、安捷倫、Waters、伍豐、賽智等),毛細管色譜柱(蘭化所、SGE、安捷倫、島津、Sigm ... |
公司信息
奶粉中的*、D3、E的測定（固相萃取-液相色譜法）
2014-12-2 閱讀(827)
目前對奶粉中脂溶性*、D3、E測定的前處理方法多采用皂化方法去除脂肪[1-7]，皂化過程后使用大量的有機溶劑進行液液萃取以洗除雜質，操作步驟復雜，*3樣品還需經硅膠柱做進一步的凈化才能進行檢測，造成實驗時間成本的增加，不利于大批量樣品的檢測。本文研究了利用固相萃取法作為奶粉樣品的前處理方法，液相色譜法作為檢測手段，實現同時測定奶粉中*、D3、E的含量，該方法可簡化奶粉樣品的前處理過程，節省有機溶劑的使用，操作簡便。
1. 樣品處理
皂化提取：2g奶粉加入1mL水混勻，加入1 mL VC/乙醇溶液破壁處理，混勻，加入10mL氫氧化鉀堿液（1.25g/mL），55℃條件下，水浴皂化45min，取出冷卻至室溫，向皂化液中加入適量無水乙醇，使之含50%乙醇，6000r/min離心5min后，取上清液，用1至2個微孔過濾器對其進行過濾，至Qdaura 卓睿™全自動固相萃取儀上樣管中作為待凈化液。
2. 固相萃取凈化
QdauraTM卓睿全自動固相萃取儀程序設定：5mL甲醇，和5mL水活化，加樣，10mL50%乙醇/水淋洗，抽干20min。2mL 丙酮，10mL乙酸乙酯洗脫，收集。收集液于40℃氮氣吹干，1mL甲醇定容，0.45um PTFE過濾器過濾，準備進液相色譜分析。
3. 色譜條件
液相色譜儀：LC-10F
色譜柱：Venusil MP C18，4.6 mm *150 mm，5µm；
流動相：甲醇；
流速：1mL/min；
柱溫：30℃；
進樣量：20µL；
波長變化見表1：
表1 波長變化梯度表
組分 | 時間/min | 波長/nm |
* | 0 | 325 |
*3 | 5 | 264 |
* | 9 | 294 |
4. 結果與討論
圖1 低濃度維生素標準溶液的色譜圖
從左至右依次為：*（5.0µg/mL）、*3（9.8µg/mL）、*（99µg/mL）
4.1 工作曲線及檢出限
根據儀器對各個物質的響應情況，將*、D3、E分別由儲備液用正己烷逐級稀釋，各稀釋成7個濃度，*濃度范圍為0.25µg/mL~25µg/mL，*3濃度范圍為0.30µg/mL~30µg/mL，*濃度范圍為2.5µg/mL~250µg/mL，將溶液進HPLC進行檢測，計算出檢出限，回歸方程及檢出限見表2。可見，液相色譜儀對*、D3、E的響應與濃度呈良好的線性關系。
表2 線性回歸方程及檢出限
化合物 | 回歸方程 | 相關系數 | 檢出限 LOD* （µg/mL） |
* | y=55.572*x-1.517 | 1 | 0.02 |
*3 | y=57.608*x-1.9814 | 1 | 0.05 |
* | y=8.1342*x-1.9094 | 1 | 0.39 |
圖2 皂化-固相萃取法色譜圖
4.2 皂化-固相萃取和傳統皂化-液液萃取法的實驗效果對比
傳統皂化-液液萃取法參考《GB 5413.9—2010食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中*、D、E 的測定》的樣品前處理2個奶粉（每個樣稱取2g）的平行樣，作為參照。同時以皂化固相萃取法做兩個平行樣品。
表3 傳統皂化-液液萃取法與皂化固相萃取法的實驗結果對比
*峰面積 | *峰面積 | *峰面積 | |
傳統皂化-液液萃取法 | 778 | 0 | 148 |
皂化固相萃取法 | 1500 | 0 | 716 |
由于選用的奶粉VD含量較低，沒有檢出。
從上述對比可以看出，皂化固相萃取法相比國標的皂化液液萃取法具有簡單的優勢，同時萃取效果更好。*的缺點是出峰靠前的*附近有較多的弱保留物質的干擾，但是依靠MP C18的強大的分離能力，可以實現分離*和干擾物質的基線分離。同時這些弱保留的物質很容易被洗脫出色譜柱，所以不會對色譜柱造成較大的污染。
4.2.3加標回收率實驗
表4 加標回收率及精密度
化合物 | 樣1（%） | 樣2（%） | 樣3（%） | 樣4（%） | 樣5（%） | 平均回收率% | RSD（%，n=5） | |
低濃度 加標 | * | 89.91 | 91.48 | 86.12 | 89.59 | 90.12 | 89.44 | 2.33 |
維生D3 | 112.36 | 114.63 | 106.34 | 111.63 | 105.35 | 110.06 | 3.83 | |
* | 85.58 | 86.87 | 81.83 | 85.64 | 84.56 | 84.90 | 2.86 | |
高濃度 加標 | * | 88.84 | 91.48 | 89.61 | 86.43 | 89.57 | 89.18 | 2.04 |
維生D3 | 93.06 | 94.65 | 93.19 | 90.38 | 92.86 | 92.83 | 1.66 | |
* | 86.68 | 87.62 | 87.00 | 83.25 | 85.94 | 86.10 | 1.98 |
4.2.3 實際樣品檢測
根據所建立的方法分析了從市場上購買的3種品牌奶粉，分別編號為1號、2號和3號按照上述方法進行樣品處理和檢測，所得*、D3和E的含量結果見表6。
圖7. 2號奶粉樣品色譜圖
表6 奶粉中維生素含量（µg/g）
化合物 | 1號 （µg/g） | 2號 （µg/g） | 3號 （µg/g） |
* | 6.008 | 42.5 | 165.0 |
*3 | 0.392 | 0.000 | 0.463 |
* | 5.712 | 6.231 | 9.344 |
4.3 結論
采用改進后的皂化-固相萃取方法來替代傳統的皂化法來測定奶粉中維生素含量，皂化能充分提取出奶粉中*，D，E，再經過Cleanert Vitamin固相萃取柱進行凈化吸附洗脫，既避免了傳統皂化中液液萃取中有機溶劑的大量使用，也簡化了操作步驟，同時能滿足一般奶粉樣品的含量分析要求。
5.訂貨信息
產品名稱 | 規格包裝 | 訂貨號 |
LC-10F液相色譜儀 | 10ml/min，梯度系統，200-800nm雙波長檢測器 | FL-LC010GS |
LC-10F液相色譜儀 | 配紫外可變波長檢測器 | LC-10F |
CC-100分析型色譜柱溫箱 | 溫控范圍：5-70℃； 可安裝1-2支300mm色譜柱 | CC-100 |
Qdaura 卓睿™全自動固相萃取儀 | 4通道24位 | SPE-40 |
Cleanert Vitamin*萃取柱 | 1g/12mL , 20支/pk | V00012 |
Venusil MP C18液相色譜柱 | 4.6 mm x150 mm，5µm | V952505-0 |
微孔過濾膜（PTFE疏水）-雙膜 | 045µm,直徑13mm,100/pk | AS041345-P |
微孔過濾膜（PVDF親水）-雙膜 | 0.45µm,直徑13mm,100/pk | AS073345-G |
一次性* | 5mL, 100/pk | ZSQ-5ML |
1.5mL樣品瓶 | 100/pk | 1109-0519 |
1.5mL樣品瓶蓋 | 100/pk | 0915-1819 |
甲醇 | 4×4L/瓶 | AH230-4 |
乙醇 | 4×4L/箱 | AH090-4 |
乙酸乙酯 | 4×4L/箱 | AH100-4 |
正己烷 | 4×4L/箱 | AH216-4 |
