本文轉(zhuǎn)自：藥品質(zhì)量研究本文轉(zhuǎn)載自“藥品質(zhì)量研究”公眾號(hào)，作者：Yvette-葉
樣品、固定相(色譜柱)和流動(dòng)相作為液相日常分析的三要素，與我們建立科學(xué)穩(wěn)健的分析方法息息相關(guān)。日常遇到的各種分析問(wèn)題，除硬件外，無(wú)外乎這三者。
從方法開(kāi)發(fā)角度來(lái)說(shuō)，從頭設(shè)計(jì)，過(guò)程中解決好這三者之間的關(guān)系，一般都能設(shè)計(jì)一套適合的方法；從重復(fù)(藥典)方法來(lái)說(shuō)，理解好各個(gè)要素的影響，就能解決好過(guò)程中無(wú)法重現(xiàn)的問(wèn)題。今天，我們就來(lái)談?wù)勔合嗳粘?yīng)用三要素之一樣品。
1、樣品組成的考慮
由于待測(cè)樣品的組成具有唯yi性，所以對(duì)于方法開(kāi)發(fā)，哪怕只是其中一個(gè)組分有差異，也可能導(dǎo)致所開(kāi)發(fā)的方法不一樣。
比如，對(duì)于以下結(jié)構(gòu)：
由于結(jié)構(gòu)的相似性，為同系物，結(jié)構(gòu)差異較少，三個(gè)組分均為中性化合物，故我們考慮的是常規(guī)色譜方法能否有效分離含這三個(gè)結(jié)構(gòu)差異較小的組分的樣品。
而對(duì)于類(lèi)似的上述另外三個(gè)組分，甲苯和丙苯由于結(jié)構(gòu)上的差異，分離是沒(méi)有問(wèn)題的。我們更多的應(yīng)該考慮2-苯丙酸是否能與甲苯有效分離。(實(shí)際上兩者是較好分離的)。
對(duì)于另外一組類(lèi)似的三個(gè)組分，更多的困難在于苯丙氨酸的有效保留問(wèn)題，以及苯丙氨酸的拖尾問(wèn)題。
從上述三個(gè)簡(jiǎn)單的小栗子可以看出，盡管樣品的組成都類(lèi)似，但是由于樣品組分組成的差異，對(duì)于分析所需要關(guān)注的點(diǎn)和所需解決的困難是有差異的。從DoE的角度來(lái)說(shuō)，開(kāi)發(fā)一個(gè)合適的方法，首先需要對(duì)樣品中的組分進(jìn)行剖析，根據(jù)各組分性質(zhì)，開(kāi)發(fā)合理的分析方法：
極性小的組合：確保各組分能全部洗脫；
極性大的組合：確保各組分能有效保留；
極性差異非常大的組合，綜合考慮，折中取舍，可選擇多套方法以同時(shí)滿足要求；
看到組分組成的時(shí)候需要考慮很多的可預(yù)見(jiàn)性問(wèn)題：選擇的分離模式，選擇的流動(dòng)相組成，選擇的固定相。
對(duì)于大部分的藥物來(lái)說(shuō)，都是可電離的，電離的程度關(guān)系到組分的疏水保留。對(duì)于酸堿化合物，電離情況如下所示：
各化合物解離的程度與疏水保留的關(guān)系如下曲線所示：
上圖中，紅色方框中為穩(wěn)定保留區(qū)域，pKa附近，微小的pH變化都能導(dǎo)致保留時(shí)間較大的差異，對(duì)于中性化合物來(lái)說(shuō)，在整個(gè)pH范圍區(qū)間內(nèi)保留均較穩(wěn)定。
2、樣品濃度的選擇
我們知道，對(duì)于一個(gè)藥品的雜質(zhì)譜，其各個(gè)雜質(zhì)的限度是有差異的，根據(jù)ICH或者藥典標(biāo)準(zhǔn)，各已知雜質(zhì)均有各自對(duì)應(yīng)的限度。又因?yàn)楦鱾€(gè)雜質(zhì)在確定的分析方法下響應(yīng)不一致，故其定量限也是不一樣的。能否對(duì)每一個(gè)雜質(zhì)都能準(zhǔn)確定量，取決于響應(yīng)低的雜質(zhì)是否滿足定量要求。若樣品濃度過(guò)低，在有關(guān)物質(zhì)(雜質(zhì))檢測(cè)中會(huì)導(dǎo)致靈敏度不夠，無(wú)法滿足定量限低于報(bào)告限的要求。
若濃度選擇過(guò)高，對(duì)于主成分含量的測(cè)試，則導(dǎo)致方法學(xué)驗(yàn)證中含量不呈線性；對(duì)于有關(guān)物質(zhì)來(lái)說(shuō)，特別是主峰后的一些雜質(zhì)，會(huì)因?yàn)橹鞒煞滞衔捕鴮?dǎo)致準(zhǔn)確度無(wú)法滿足要求；另外，一般情況下，會(huì)用流動(dòng)相來(lái)進(jìn)行稀釋?zhuān)糁鞒煞譂舛忍撸瑒t會(huì)改變供試品的溶液環(huán)境，使其中帶檢測(cè)的某一組分出峰與其對(duì)照品有差異。
3、樣品稀釋劑的選擇
說(shuō)到樣品的稀釋劑，這是咱們分析人員常碰到的問(wèn)題，也是熟悉的問(wèn)題。但凡做分析的小伙伴，都能對(duì)溶劑效應(yīng)道出個(gè)123來(lái)。
對(duì)于溶劑效應(yīng)，小伙伴們的第yi反應(yīng)肯定是在反相色譜分析過(guò)程中，由于用純乙腈/純甲醇等高比例有機(jī)相溶解樣品，然后在進(jìn)樣后發(fā)現(xiàn)色譜圖中處于前面的峰發(fā)生裂峰的問(wèn)題。這是由于供試品中的溶劑強(qiáng)度高于流動(dòng)相的關(guān)系。解決方式除了可以換稀釋劑外，還可以嘗試減少進(jìn)樣量來(lái)進(jìn)行改善。
另一種溶劑效應(yīng)是由于樣品的加入，導(dǎo)致供試品的pH和流動(dòng)相的pH差異較大，導(dǎo)致流動(dòng)相無(wú)法在短時(shí)間內(nèi)讓進(jìn)樣的供試品達(dá)到平衡而導(dǎo)致出峰異常，包括峰形異常和出峰時(shí)間與對(duì)照品有差異。
稀釋劑的選擇還可能會(huì)造成鹽析。特別是對(duì)于一些從原料藥方法衍生而來(lái)的針對(duì)制劑的檢測(cè)方法。由于制劑中輔料成分相對(duì)更加復(fù)雜，某些原料藥使用的稀釋劑可能會(huì)讓制劑供試品產(chǎn)生鹽析，導(dǎo)致出峰異常或者影響組分的回收率，影響檢測(cè)的重現(xiàn)性，甚至導(dǎo)致色譜柱及儀器堵塞。
后一種情況則是由于溶出等特殊情況，導(dǎo)致供試品溶液中有其他成分，如SDS等，干擾測(cè)試，導(dǎo)致出峰異常；或者是由于溶出液pH不一致，導(dǎo)致的出峰異常，這個(gè)情況與前述的pH不一致歸因一致。
